Titolo: The Role of Iron and Mitochondria in the Pathogenesis of Pantothenate Kinase Associated Neurodegeneration (PKAN) (A. ZEBRACA)
Sintesi del progetto:
Il progetto “Zebrafish Brain and Coenzyme A – ZEBRACA” rappresentava la continuazione (tipologia FURTHER) di attività di ricerca finanziate dalla Fondazione Telethon.
Gli obiettivi principali erano i seguenti:
a) ulteriore caratterizzazione molecolare del modello transiente di PKAN
b) sviluppo e caratterizzazione morfo-funzionale di pesci con delezione di pank2
c) caratterizzazione morfo-funzionale del deficit di coenzyme A synthase (coasy) in zebrafish.
a) Ulteriore caratterizzazione molecolare del modello transiente di PKAN
Abbiamo ulteriormente analizzato le conseguenze di difetti a carico di pank2 sullo sviluppo
embrionale attraverso diversi approcci.
1) La microiniezione di un morfolino specifico in linee transgeniche con espressione di EGFP sotto
il promotore di fli1a e neurod1. Tale analisi e confluita in un lavoro sottomesso per la pubblicazione
dal titolo Analysis of vasculature development in zebrafish embryos with reduced expression of
pantothenate kinase 2 gene.” Deepak Khatri, et al.
2) L’overespressione di mutanti di pank2 on embrioni di zebrafish. La ricerca è descritta in un
manoscritto accettato per la pubblicazione dalla rivista NeuroMolecular Medicine: “Overexpression
of Human Mutant PANK2 Proteins Affects Development and Motor Behavior of Zebrafish
Embryos”, Deepak Khatri et al. https://rdcu.be/42Lx.
3) Il silenziamento del gene pank2 in cellule HUVEC per valutare gli effetti sull’angiogenesi in un
sistema di cellule umane. La ricerca è descritta in un manoscritto accettato per la pubblicazione su
Molecular Medicine Reports, “Silencing of pantothenate kinase 2 reduces endothelial cell
angiogenesis”, Francesca Pagani et al.
b) Sviluppo e caratterizzazione morfo-funzionale di pesci con delezione di pank2.
Tale punto è stato sviluppato principalmente dal dottorando dott. Deepak Khatri. Grazie alla messa
a punto della tecnica di “genome editing” basata sul sistema CRISPR-CAS9 abbiamo ottenuto 3
linee con indels in omozigosi in corrispondenza dell’esone 1 del gene pank2. Si tratta di due
delezioni, di 4 e 50 nucleotidi, e di un inserzione di 19 nucleotidi. Tutte comportano l’alterazione
del frame di lettura del mRNA con conseguente comparsa di codoni di stop prematuri, e quindi di
proteine tronche e non funzionali. Abbiamo propagato presso la facility Zebrafish del DMMT le
due linee con delezioni di 4 e 50 nucleotidi, riuscendo anche a trasferire le mutazioni in background
transgenici, con espressione di EGFP sotto il controllo del promotore neurod1 (marcatore
neuronale) e kdrl1 (marcatore endoteliale). Abbiamo validato le linee tramite immunoblotting con
un anticorpo specifico per PANK2 evidenziando la scomparsa della proteina di interesse; ad
ulteriore conferma delle linee mutanti, documentato un processo di mRNA non-sense decay a carico
del messaggero specifio per pank2 e riscontrato un netto incremento dell’espressione dell’enzima
Coasy, senza modifiche di quella dei paraloghi pank1a e pank1b. In seguito, abbiamo verificato la
mancata attività di una molecola morfolino usata in precedenza nel modello transiente ed
evidenziato una riduzione significativa del contenuto di CoA negli embrioni mutati. La
caratterizzazione morfo-funzionale degli embrioni ha evidenziato la presenza di alterazioni a carico
dello sviluppo neuronale che confermano quanto osservato in precedenza nei morfanti. Ciò è
particolarmente evidente nella linea transgenica per neurod1, che documenta una riduzione
dell’espressione del marcatore neuronale in diverse aree cerebrali e nella corda spinale (fig 5).
DIPARTIMENTO DI MEDICINA MOLECOLARE E TRASLAZIONALE
SEZIONE DI BIOTECNOLOGIE
Prof Dario Finazzi
Tel. 030 3717334…. – E-mail: dario.finazzi@unibs.it
L’aggiunta di CoA all’acqua consente uno sviluppo embrionale normale, come evidenziato dalla
scomparsa dei fenotipi morfologici e dal ripristino di normali livelli di espressione del marcatore
neuronale neurod1 Grazie all’utilizzo di nuova strumentazione (Noldus) abbiamo valutato il
comportamento motorio delle larve a 4 e 5 dpf, riscontrando una parziale riduzione del movimento
spontaneo a 5 dpf.
I dati sono stati presentati a congressi internazionali, come poster (2nd International FishMed
Conference on Zebrafish Research, Warsaw, e comunicazioni orali (The 5th European Zebrafish
Principal Investigator Meeting, Trento, StellenCoA 2018: SASBMB Focused Meeting on
Coenzyme A, Stellenbosch South Africa).
c) Caratterizzazione morfo-funzionale del deficit di coenzyme A synthase (coasy) in zebrafish.
Tale attività è stata in parte sviluppata prima dell’approvazione del progetto ed e confluita nella
pubblicazione :
Down-regulation of coasy, the gene associated with NBIA-VI, reduces Bmp signaling, perturbs
dorso-ventral patterning and alters neuronal development in zebrafish.
Khatri D, Zizioli D, Tiso N, Facchinello N, Vezzoli S, Gianoncelli A, Memo M, Monti E, Borsani
G, Finazzi D. Sci Rep. 2016 Nov 28;6:37660. doi: 10.1038/srep37660.
Allo stato attuale stiamo continuando tale linea con la generazione di linee KO con la stessa
procedura descritta sopra. Abbiamo ottenuto due linee, rispettivamente con delezione di 10
nucleotidi ed inserzione di 10 nucleotidi. Entrambe comportano un’alterazione del frame di lettura
con comparsa di codoni di stop prematuri. Dovrebbero quindi comportare proteine non funzionali
Sono in corso le procedure per la generazione delle linee omozigoti.
Elenco delle pubblicazioni con riconoscimento dei fondi Health&Wealth
1: Pagani F, Trivedi A, Khatri D, Zizioli D, Garrafa E, Mitola S, Finazzi D. Silencing of
pantothenate kinase 2 reduces endothelial cell angiogenesis. Mol Med Rep. 2018 Nov;18(5):4739-
4746. doi: 10.3892/mmr.2018.9480. Epub 2018 Sep 13. PubMed PMID: 30221726.
2: Khatri D, Zizioli D, Trivedi A, Borsani G, Monti E, Finazzi D. Overexpression of Human
Mutant PANK2 Proteins Affects Development and Motor Behavior of Zebrafish Embryos.
Neuromolecular Med. 2019 Jun;21(2):120-131. doi:10.1007/s12017-018-8508-8. Epub 2018 Aug
23. PubMed PMID: 30141000.
3: Khatri D, Zizioli D, Tiso N, Facchinello N, Vezzoli S, Gianoncelli A, Memo M, Monti E,
Borsani G, Finazzi D. Down-regulation of coasy, the gene associated with NBIA-VI, reduces Bmp
signaling, perturbs dorso-ventral patterning and alters neuronal development in zebrafish. Sci Rep.
2016 Nov 28;6:37660. doi: 10.1038/srep37660. PubMed PMID: 27892483; PubMed Central
PMCID: PMC5124858.
4: Khatri D, Mignani L, Zizioli D, Ritelli M, Monti E, Finazzi D. Abnormal Vasculature
Development in Zebrafish Embryos with Reduced Expression of Pantothenate Kinase 2 Gene. Bull
Exp Biol Med. 2020 Nov;170(1):58-63. doi:10.1007/s10517-020-05004-3.
Partner:
Università degli Studi di Padova
Coordinatore del Progetto: Prof. Dario Finazzi
Dipartimento di Medicina Molecolare e Traslazionale